四、顯色和比色

   TMB 經(jīng)HRP 作用后，約40 分鐘顯色達(dá)ding峰，隨即逐漸減弱，至2 小時(shí)后即可wan全消退至無(wú)色。TMB 的終止液有多種，疊氮鈉和十二烷基硫酸鈉(SDS)等酶抑制劑均可使反應(yīng)終止。這類終止劑尚能使藍(lán)色維持較長(zhǎng)時(shí)間(12-24 小時(shí))不褪，是目視判斷的良好終止劑。此外，各類酸性終止液則會(huì)使藍(lán)色轉(zhuǎn)變成黃色，此時(shí)可用特定的波長(zhǎng)(450nm)測(cè)讀吸光值。酶標(biāo)比色儀簡(jiǎn)稱酶標(biāo)儀，通常指專用于測(cè)讀ELISA 結(jié)果吸光度的光度計(jì)。酶標(biāo)儀的主要性能指標(biāo)有：測(cè)讀速度、讀數(shù)的準(zhǔn)確性、重復(fù)性、精確度和可測(cè)范圍、線性等等。優(yōu)良的酶標(biāo)儀的讀數(shù)一般可精確到0.001，準(zhǔn)確性為±1%，重復(fù)性達(dá)0.5%。酶標(biāo)儀不應(yīng)安置在陽(yáng)光或強(qiáng)光照射下，操作時(shí)室溫宜在15 -30℃ ，使用前先預(yù)熱儀器 15-30 分鐘，測(cè)讀結(jié)果更穩(wěn)定。

   測(cè)讀 A 值時(shí)，要選用產(chǎn)物的敏感吸收峰，如OPD用492nm 波長(zhǎng)。有的酶標(biāo)儀可用雙波長(zhǎng)式測(cè)讀，即每孔先后測(cè)讀兩次，兩次在zui適波長(zhǎng)(W1)，第二次在不敏感波長(zhǎng)(W2)，兩次測(cè)定間不 移動(dòng)ELISA 板的位置，zui終測(cè)得的A 值為兩者之差(W1-W2)。雙波長(zhǎng)式測(cè)讀可減少由容器上的劃痕或指印等造成的光干擾。 肉眼判斷結(jié)果時(shí)，顯色淺不易觀察，影響結(jié)果的準(zhǔn)確性，必須使用酶標(biāo)儀檢測(cè)，以保結(jié)果一致性。

五、HooK效應(yīng)影響

   隨著ELISA一步法的應(yīng)用，一些標(biāo)本中抗原含量過(guò)高，產(chǎn)生HooK效應(yīng)。影響檢測(cè)結(jié)果，采用同步稀釋測(cè)定或使用線性范圍高的兩對(duì)半定量法可以減HooK反應(yīng)的發(fā)生。

六、干擾物質(zhì)的影響

   有人認(rèn)為大約 40%的人血清標(biāo)本中含有非特異性干擾物質(zhì)，可以不同程度影響檢測(cè)結(jié)果;常見(jiàn)的干擾物質(zhì)有：類風(fēng)濕因子、補(bǔ)體、嗜異性抗體、嗜靶抗原自身抗體、醫(yī)源性誘導(dǎo)的抗鼠Ig (s)抗體、交叉反應(yīng)物質(zhì)和其它物質(zhì)等。如RF因子可與標(biāo)記二抗的FC段法結(jié)合造成假陽(yáng)性，補(bǔ)體從C1q活化，使一抗和酶標(biāo)二抗的抗體分子發(fā)生變構(gòu)，F(xiàn)c的C1q分子結(jié)合點(diǎn)暴露出來(lái)，則補(bǔ)體C1q可將二者連接起來(lái)造成假陽(yáng)性，采用56℃30分鐘滅活補(bǔ)體可降低假陽(yáng)性率，高濃度的AFP(如孕婦)，在儲(chǔ)存過(guò)程中可能形成二聚體會(huì)導(dǎo)致本底過(guò)深影響檢測(cè)結(jié)果。

七、藥物的影響

   高效價(jià)的乙肝免疫球蛋白會(huì)與 HBsAg形成復(fù)合物，影響HBsAg的檢出，所以一些HBsAg陽(yáng)性患者注射乙肝免疫球蛋白后，HBsAg檢測(cè)會(huì)呈陰性反應(yīng)，導(dǎo)致乙肝兩對(duì)半少見(jiàn)模式的出現(xiàn)，如我們常遇到乙肝大三陽(yáng)的孕婦，為阻斷乙肝母嬰垂直傳播時(shí)，在孕第8、9、10月常規(guī)注射200mg乙肝免疫球蛋白，不僅影響孕婦HBsAg的檢出;而且其所生產(chǎn)的生新兒也常出現(xiàn)HBsAg陰性，HBeAg 陽(yáng)性和HBcAb陽(yáng)性等少見(jiàn)模式、可能是乙肝免疫球蛋白屬IgG抗體能通過(guò)胎盤進(jìn)入胎兒體內(nèi)與胎兒血液中的HBsAg結(jié)合形成復(fù)合物;則新生兒HBsAg檢測(cè)呈陰性;用0.5M的鹽酸處理標(biāo)本1小時(shí)可提高出率。 為預(yù)防乙肝，部分 HBsAg陰性人群在接種乙肝疫苗后的1—2周內(nèi)，血清中可檢出HBsAg成份，形成一過(guò)性HBsAg陽(yáng)性，這可能是乙肝疫苗主要成分是HBsAg.，有方法能夠把它檢出;如電化學(xué)發(fā)光法，建議接種乙肝疫苗后1個(gè)月內(nèi)不應(yīng)作HBsAg檢測(cè)。

八、抗原自身因素

   融合蛋白對(duì)基因工程抗原特異性的影響。以丙肝診斷 試劑 盒為例為例，因?yàn)榘坏幕蚬こ炭乖瓰槿诤系鞍?，包含了?lái)自表達(dá)載體的一些序列可以與血清中抗大腸桿菌的因子發(fā)生反應(yīng)而產(chǎn)生了可疑標(biāo)本。少數(shù) HBV感染后外周血中不含HbsAg。HBV感染后絕大多數(shù)感染者外周血中可出現(xiàn)HBsAg， 含量在5ng～600μg/ml之間。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，到目前為止在獻(xiàn)血員中所發(fā)現(xiàn)的HBsAg 攜帶者zui低含量為0.2 ng/ml。含量高者可達(dá)2000μg/ml以上。但有少部分HBV感染者血清HBsAg測(cè)定為陰性，如暴發(fā)性乙型肝炎、HBV的S基因發(fā)生變異等。急性重癥乙型肝炎，肝細(xì)胞中以合成HBcAg為主，很少或不合成HBsAg，從而使外周血中無(wú)HBsAg。HBV的前S/S基因編碼HBsAg，構(gòu)成病毒外膜，根據(jù)所帶亞型決定簇的不同分為adw、adr、ayw和ayr。

   a決定簇具有很高的免疫原性，在HBV的自然感染或注射HBsAg 疫苗可引起抗HBs應(yīng)答。如S基因145密碼子變異使得其原來(lái)的甘氨酸被精氨酸替代時(shí)，可致a決定簇的抗原性發(fā)生改變，使機(jī)體產(chǎn)生的抗體對(duì)變異株無(wú)作用，且可引起HBV感染患者血清中同時(shí)出現(xiàn)HBsAg和抗HBs。同時(shí)乙肝疫苗接種也不能有效預(yù)防此類變異病毒的感染。乙型肝炎病毒S基因的變異有自然變異和逃避免疫變異，變異可發(fā)生在多個(gè)部位，而且?guī)滋幫蛔兛赏瑫r(shí)存在，這些變異有助于病毒攜帶狀態(tài)的持續(xù)存在。近來(lái)，有研究表明，前S1區(qū)丟失突變(氨基酸58～118)是引起HBsAg陰性的HBV感染的重要原因，S啟動(dòng)子位于前S1，是合成HBsAg的調(diào)節(jié)元件，前S1的丟失突變則會(huì)影響S啟動(dòng)子的功能，進(jìn)而影響HBsAg的合成。

總之，優(yōu)質(zhì)的 試劑，良好狀態(tài)的儀器，排除各種影響因素的干擾和正確的操作是保證ELISA 檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠的必要條件。